О Центре Администрация Ученый совет Структура Достижения Аспирантура Контакты Карта сайта

 

ГРУППА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ГРИБОВ 

Области интересов
Состав Группы
Основные достижения 
Проекты, Сотрудничество и партнеры
Избранные публикации и Патенты

Группа генетической инженерии грибов (ранее – группа генетической инженерии дрожжей) создана в 1989 году, т.е. существует с момента образования Центра «Биоинженерия» РАН. 

Нас интересуют стратегии создания эффективных штаммов микроорганизмов –продуцентов практически важных гетерологичных белков: факторов роста, вирусных антигенов, промышленных и медицинских ферментов. Группа также занята изучением закономерностей формирования вирусоподобных частиц на основе вирусов растений и капсидных белков вирусов животных в целях получения новых вакцин. Мы разрабатываем методы аффинной очистки и иммобилизации рекомбинантных белков, изучаем молекулярные механизмы биосинтеза бета-лактамных антибиотиков у промышленных штаммов грибов. 

Руководитель группы:

ЭЛЬДАРОВ МИХАИЛ АНАТОЛЬЕВИЧ
кандидат биологических наук

тел.: 8 (499)-135 -6219
факс: 8 (499)-135-0571
e-mail: meldarov@mail.ru 

Области интересов: 

1) Структурно-функциональные исследования промышленных ферментов. 

Оксидазы D-аминокислот и GL7ACA-ацилазы – важные промышленные ферменты, широко используемые в современных биокаталитических технологиях синтеза 7-аминоцефалоспорановой кислоты – исходного соединения-предшественника для получения полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков. 
Нами созданы рекомбинатные аналоги оксидазы и ацилазы, модифицированные присоединением различных аффинных групп – хитин-связывающего домена хитиназы А1 Bacilluscirculans, олигогистидиновых остатков, отработаны условия ферментации штаммов и получения очищенных препаратов ферментов. Показано, что использованные аффинные модификации не влияют на ферментативные свойства, процессинг и фолдинг рекомбинатных ферментов, а полученные гибридные белки могут быть легко очищены или напрямую иммобилизованы на хитиновых сорбентах. 
Проводятся исследования по дизайну и получению аналогов этих ферментов с улучшенными физико-химическими и каталитическими характеристиками.


2) Исследование молекулярного контроля биосинтеза цефалоспорина С у мицелиального гриба Acremonium chrysogenum. 

Цефалоспорины - обширный класс антибиотиков с мощным бактерицидным действием, низкой токсичностью, широким терапевтическим диапазоном.   Исходным субстратом для получения полусинтетических цефалоспоринов является цефалоспорин С (цефС), продуцируемый  аскомицетом Acremonium_chrysogenum. 
Создание новых высокоэффективных  промышленных штаммов-продуцентов цефС требует углубленного понимания тонких молекулярных и физиологических механизмов регуляции биосинтеза бета-лактамных антибиотиков у мицелиальных грибов и совершенствования  методов генетических манипуляций с этими микроорганизмами. Мы изучаем особенности регуляции транскрипции основных генов биосинтеза и транспорта цефС и структурные особенности ферментов биосинтеза цефС.  Для  совершенствования методов генетического манипулирования с  A.chrysogenum мы  разрабатываем  системы   генетической трансформации методом агробактериального переноса  штаммов  Acremonium chrysogenum дикого типа и полученного на его основе в результате многоступенчатого отбора промышленного штамма-суперпродуцента цефалоспорина С.

3) Конструирование вирусоподобных частиц для создания новых вакцин. 
Фитовирусные вектора на основе геномов распространенных вирусов растений широко используются в качестве инструментов для разработки систем продукции в растениях различных целевых белков и получения высокоиммуногенных вирусоподобных частиц для создания новых диагностических и вакцинных препаратов. 
В сотрудничестве с кафедрой вирусологии Биологического факультета МГУ, Центром Джона Иннеса, Институтом Гриппа РАМН мы исследуем возможность использования химерных вирусоподобных частиц на основе вируса Х картофеля и вируса мозаики коровьего гороха, несущих протективные эпитопы вируса гриппа для создания кандидатных противогриппозных вакцин.
Для преодоления некоторых ограничений фитовирусных векторов мы используем в качестве носителя чужеродных эпитопов нуклеокапсидный белок вируса гепатита В человека, или HbcAg. Нами показано, что синтезируемый в клетках растений под контролем векторов на основе Х-вируса картофеля, вируса табачной мозаики и вируса коровьего гороха HbcAg способен самостоятельно собираться в частицы и его синтез не препятствует процессам репликации, сборки и транспорта использованных вирусных векторов. 

4) Поиск и исследование новых аспарагиназ микроорганизмов 
Бактериальные L-аспарагиназы на протяжение десятилетий широко используются в онкологической практике для лечения острых лимфобластных лейкозов, лимфо- и ретикулосарком человека. Известно, что аспарагиназная терапия сопровождается серьезными побочными эффектами, приводящими к снижению терапевтической эффективности доступных коммерческих препаратов аспарагиназ выделенных из Escherichia coli и Erwinia chryzanthemi. В этой связи, для проведения необходимых курсов комбинированной химио- и энзимотерапии лейкозов целесообразно располагать набором L-аспарагиназ, обладающих высокой ферментативной активностью, но отличающихся по своим антигенным свойствам и обладающих сниженной токсичностью. 

Совместно с НИИ БМХ РАМН и другими организациями нами разработана технология получения новой микробной L-аспарагиназы из бактерии Erwinia carotovora, показана высокая противоопухолевая активность этого фермента по отношению к злокачественным клеткам крови и низкая токсичность. 

Нами выделен ген YccC аспарагиназы, кодирующий ранее не исследованный гомолог L-аспарагиназы Bacillus subtilis, разработаны высокоэффективные методы экспрессии и очистки рекомбинантной YccC, осуществлена ее подробная энзиматическая характеристика, определяющая перспективность использования этой аспарагиназы для создания новых лекарственных препаратов. 
Продолжается поиск новых L-аспарагиназ на основании данных геномных исследований микроорганизмов. 

Состав группы:

>

ФИО

Должность, ученая степень

E-mail:

 

Эльдаров Михаил Анатольевич 

Руководитель группы, 

ведущий научный сотрудник, 

к.б.н.

meldarov@mail.ru 

Думина Мария

младший научный сотрудник, к.б.н.

Жгун Александр Александрович

научный сотрудник, к.б.н.

 

zhgun@biengi.ac.ru 

Авданина Дарья Александровна

научный сотрудник, к.б.н.

daria.avdanina@biengi.ac.ru 

     

Контакты – Жгун Александр Александрович, zhgun@biengi.ac.ru 

Наиболее важные достижения

Разработана технология получения промышленных ферментов для биотрансформации антибиотиков. 

Получены эффективные штаммы бактерий и дрожжей, продуцирующие оксидазу D-аминокислот Trigonopsis variabilis (TvDAO) и GL7ACA-ацилазу Brevunimonas diminuta (BrdGl7ACA) в виде гибридных белков с хитин-связывающими доменами бактериальных хитиназ.
Разработанные методы экспрессии и очистки оксидазы и ацилазы могут быть использованы для углубленного структурно-функционального изучения данных ферментов, создания их аналогов с улучшенными физико-химическими и ферментативными свойствами, разработки экономичных и эффективных технологий получения иммобилизованных препаратов для непосредственного использования в технологических процессах. 

Исследованы механизмы комплексообразования в Р450-зависимых монооксигеназных ферментных системах и созданы прототипы биосенсоров на основе Р450. 
Усовершенствованы системы гетерологичной экспрессии ряда важных для медицины и биотехнологии цитохромов Р450 млекопитающих и их белков- партнеров. Разработаны системы и методы выделения и очистки рекомбинатных Р450, реконструкции Р450-зависимых монооксигеназных систем in vivo и in vitro. Исследованы механизмы комплексообразования и переноса электрона в Р450-зависимых ферментных системах, сконструированы прототипы биоаналитических устройств на основе иммобилизованных методами нанотехнологии цитохромов для детекции различных лекарственных соединений и метаболитов.

Разработаны подходы к использованию рекомбинантных факторов роста для терапии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. 

Впервые изучена динамика концентраций сосудистого эндотелиального фактора роста (VFGF) и основного фактора роста фибробластов (bFGF) у больных ишемической болезнью сердца (ИБС), подвергнутых коронарной ангиопластике. Показано, что уровни VEGF и bFGF в крови при поражении коронарных артерий объективно отражают состояние коронарного русла, а динамика концентрации bFGF после эндоваскулярных вмешательств может служить прогностическим маркером отдаленных последствий. 
Установлена ключевая роль альтернативного сплайсинга как основного механизма регуляции экспрессии изоформ VEGF в различных тканях человека. Сконструирована панель векторов, направляющих синтез изоформ VEGF, других сосудистых факторов роста для использования в различных схемах терапевтического ангиогенеза 
Создан рекомбинантный штамм дрожжей-сахаромицетов, продуцирующий в секретируемой форме и с высоким выходом биологически-активный эпидермальный фактор роста человека (ЧЭФР). В сотрудничестве с другими лабораториями Центра высокоочищенный препарат ЧЭФР использован для создания коньюгатов с цитостатическими агентами и антибиотиками для разработки противоопухолевых препаратов направленного действия.


Проекты

Участие в федеральных целевых программах

ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы"

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 17.06.2014 №14.604.21.0022 с Минобрнауки России по теме: Синтетаза цефалоспоринов-кислот,
выполнялись следующие работы:

1.1 Аналитический обзор информационных источников.

1.2 Обоснование и выбор направления исследований.

1.3 Расшифровка генома штамма Escherichia coli CZ-08 – продуцента новой синтетазы цефалоспоринов-кислот (Cephalosporin Acid Synthethase, CASA).

1.4 Идентификация методами биоинформатики гена синтетазы цефалоспоринов кислот (CASA).

1.5 Выделение гена CASA

1.6 Создание конструкций для экспрессии гена CASA в клетках E.coli и выбор наиболее оптимальной конструкции.

1.7 Разработка методики определения ферментативной активности CASA.

1.8 Разработка методики контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина.

1.9 Биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей генома штамма Escherichia coli CZ-08.

1.10 Проведение патентных исследований.

При этом были получены интересные и значимые результаты (см. вложение).

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Госконтракты в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»  

2005 
“Recombinant Erwinia carotovora L-asparaginase - development of the experimental - industrial technology for production of substance, pharmacological preparations, preclinical trials, structure-functional studies and creation of modified forms with improved pharmacological properties"

№2828р 
Разработка экспериментально-производственной технологии получения субстанции, создание образцов лекарственной формы, доклинические испытания субстанции, структурно-функциональное изучение и получение модифицированных форм с улучшенными фармакологическими свойствами рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora. 

2005-2006
«Создание трансгенных растений –биопродуцентов белков медицинского назначения с иммуномодулирующим действием»

2007 
«Разработка магнитометрического биосенсора на основе магнитных наночастиц для диагностики инфекционных заболеваний»,

2007-2008
1) Создание систем экспрессии в растениях вакцинных белков вируса краснухи, основанных на использовании самореплицирующихся фитовирусных векторов 

2) Экспрессия в растениях с помощью вирусов-вектров белков медицинского назначения: вакцинных белков вируса гриппа и миелоцитокинов человека.

2008-2009
Исследование молекулярного контроля биосинтеза цефалоспорина С в мицелиальном грибе Aсremonium сhrysogenum. 


ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. 

2012-2013
“Роль мембранных транспортных белков в регуляции продукции цефалоспорина С у Acremonium chrysogenum”. В рамках проекта разработаны дополнительные образовательные лекционные материалы для школьников и школьных учителей «антибиотики – общая характеристика» и «механизмы действия»,
а для студентов старших курсов и магистров по специальностям биотехнология и биоинженерия на тему:
«Молекулярный контроль биосинтеза бета-лактамных антибиотиков».

Гранты РФФИ 
1. 06-04-49792 Молекулярная основа лекарственной устойчивости клеток лейкозов человека к бактериальной L-аспарагиназе.

2. 07-04-12204 офи Исследование молекулярных механизмов взаимодействия хитин-связывающих доменов белков с природными и модифицированными лигандами и созданиe сорбетов с заданной селективностью для аффинной очистки и иммобилизации рекомбинантных белков. 

Сотрудничество и партнеры 

 Кафедра вирусологии Биологического факультета МГУ (зав.кафедрой – академик РАН и РАСХН И.Г.Атабеков). 
 НИИ Биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН (д.б.н. Н.Н.Соколов) 
 Лаборатория гипертермофильных микробных сообществ (рук. д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловская) Института Микробиологии им. Виноградского РАН 
 Лаборатория криоэлектроники Физического факультета МГУ (рук. д.б.н. Снигирев О.В.) 
 Отдел биологической химии, Центр Джона Иннеса, Норвич, Великобритания – д-р Джордж Ломоноссофф. 
 Институт гриппа РАМН

Избранные публикации:

2010-2011

1. Редо В.А., Новикова Е.К., Эльдаров М.А. Экспрессия модифицированной оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris. Прикл. Биохимия микробиол. 2011, Т.47, №1, C.39-45.

2.Naletova IN, Popova KM, Eldarov MA, Kuravsky ML, Schmalhausen EV, Sevosty-anova IA, Muronetz VI. Chaperonin TRiC assists the refolding of sperm-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Arch Biochem Biophys. 2011, 516(1):75-83.

3.Т.С.Калебина, И.О.Селях, А.А.Горковский, Е.Е.Безсонов, М.А.Элъдаров, М.И.Новак, А.Г.Домрачева, Ю.Э.Бартошевич (2010) Особенности структуры клеточных стенок Acremonium chrysogenum - продуцента цефалоспорина С. Прикл.биохим.микробиол.Т.46, С.:666-671.

4. A.Я.Валиахметов, Л.В.Трилисенко, В.М.Вагабов, Ю.Э.Бартошевич, И.С.Кулаев, М.И.Новак, А.Г.Домрачева, М.А.Эльдаров, К.Г.Скрябин (2010) Динамика содержания неорганических полифосфатов при синтезе цефалоспорина С у Acremonium chrysogenum. Прикл.биохим.микробиол.Т.46, С:198-204.

5.Андрианова Е.П., Крeменчугская С.Р., Луговская Н.Н., Майорова Т.К., Борисов В.В., Эльдаров М.А., Равин Н.В., Фолимонов А.С., Скрябин К.Г. «Полиэпитопный белок вируса ящура, полученный в бактериях и растениях, вызывает протективный иммунитет в морских свинках». Биохимия, 2011, том 76, 415-424.

6.Elkina YL, Kuravsky ML, El'darov MA, Stogov SV, Muronetz VI, Schmalhausen EV. Recombinant human sperm-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: structural basis for enhanced stability. Biochim Biophys Acta. 2010 Dec;1804(12):2207-12.

7.Eldarov MA, Mardanov AV, Beletsky AV, Ravin NV, Skryabin KG. Complete seuence and analysis of the mitochondrial genome of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha DL-1. FEMS Yeast Res. 2011, 11:464-472.

2005-2008

1. Ю.А.Мещерякова, М.А.Эльдаров, Л. Билс, К.Г. Скрябин, Д.П.Ломоноссофф (2008).
«Получение вирусоподобных частиц нуклеокапсидного белка вируса гепатита Б в растениях с помощью вектора на основе Вируса Мозаики Коровьего Гороха». Вопросы вирусологии, №4. 

2. Khatuntseva SA, Eldarov MA, Redo VA, Skryabin KG (2008). Purification and immobilization of recombinant variants of Brevundimonas diminuta glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase expressed in Escherichia coli cells. J. Biotechnol. 133(1):123-6.

3. Хатунцева С.А., Эльдаров М.А., Лопатин С.А., Зейналов О.А., Скрябин К.Г. (2007) «Клонирование и экспрессия вариантов ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta в клетках E.coli», Прикл. Биохимия микробиол. Т.41, №4, с.462-470. 

4. Mechtcheriakova IA, Eldarov MA, Nicholson L, Shanks M, Skryabin KG, Lomonossoff GP. The use of viral vectors to produce hepatitis B virus core particles in plants. J. Virol Methods. 2006, 131(1), 10-5. 

5. Скрябин К.Г., Эльдаров М.А., Камардинов Д.К., Зиновьева М.В., Иванов Д.С., Прасолов В.С., Матцкеплишвили С.Т., Бузиашвили Ю.И., Петров Р.В., Бокерия Л.А., Кирпичников М.П. «Дифференциальная экспрессия изоформ сосудисто-эндотелиального фактора роста человека и новые подходы к терапевтическому ангиогенезу" Доклады Академии Наук, 2004, 397, 6, 1-4. 

6. Слободкина Г.Б., Черных Н.А., Лопатин С.А., Ильина А.В., Банникова Г.Е., Анкенбауэр В., Эльдаров М.А., Варламов В.П., Бонч-Осмоловская Е.А. «Выделение и характеристика термостабильной ДНК-полимеразы гипертермофильной археи Thermococcus litoralis Sh1AM». Прикл. Биох. Микробиол., 2005, 41: 1-8.

7. Соколов Н.Н., Эльдаров М.А., Сидорук К.В., Жгун А.А., Борисова А.А., Александрова С.С., Омельянюк Н.М., Богуш В.Г., Красоткина Ю.В., Гервазиев Ю.В., Покровская М.В., Соков Б.Н., Березов Т.Т., Скрябин К.Г., Арчаков А.И. «Разработка противоопухолевого препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora». Молекулярная медицина, 2005, №1, 45-52.

8.Омельянюк Н.М, Борисова А.А., Александрова С.С., Покровская М.В., Эльдаров М.А., Арчаков А.И., Скрябин К.Г., Соколов Н.Н.. “Оптимизация экспрессии рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora”. Биотехнология. 2005, №3, с. 27-34. 

Патенты: 
1. Жгун А.А., Носков В.В., Керпичников И.В., Эльдаров М.А., Думина М.В. «Рекомбинантная плазмидная ДНК pZEN16 для переноса и экспрессии Acremonium chrysogenum» патент РФ № 2434944 от 27.11.2011.

2.Хатунцева С.А., Эльдаров М.А., Зейналов О.А., Скрябин К.Г. РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК G17ACA-АЦИЛАЗЫ С ХИТИН-СВЯЗЫВАЮЩИМ ДОМЕНОМ (BrdG17ACA-cbd), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSVH0108, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЕГО СИНТЕЗ В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-ПРОДУЦЕНТ BrdG17ACA-cbd. Патент РФ № 2388826 от 10.05.2010.

3. Хатунцева С.А., Эльдаров М.А., Зейналов О.А., Скрябин К.Г. Рекомбинантная плазмида pSVH0106, обеспечивающая синтез Gl7ACA-ацилазы в клетках Escherichia coli, и рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0106 – продуцент Gl7ACA-ацилазы. Патент РФ №2300566 от 2007.06.10. 

4. Эльдаров М.А., Редо В.А., Жгун А.А., Зейналов О.А., Скрябин К.Г. Рекомбинантная плазмида pETTvDAO2, обеспечивающая синтез оксидазы D-аминокислот (DAO) дрожжей Trigonopsis variabilis в клетках Escherichia coli, и рекомбинантный штамм Escherichia coli C41(DE3)/ pETTvDAO2 – продуцент DAO. Патент РФ №2310687 от 20.11.2007.

5. Редо В.А., Эльдаров М.А., Жгун А.А., Хатунцева С.А., Зейналов О.А., Скрябин К.Г. Рекомбинантная ДНК, кодирующая функционально-активный гибридный белок оксидазы D-аминокислот с хитин-связывающим доменом (DAOcbd), рекомбинантная плазмида pVR1, обеспечивающая его в клетках Escherichia coli, и рекомбинантный штамм Escherichia coli C41(DE3)/pVR1 – продуцент DAOcbd. Патент РФ № 2310688. 

6. Эльдаров М.А., Кагиянц С.М., Позмогова Г.Е., Луценко С.В., Северин Е.С., Кирпичников М.П., Скрябин К.Г. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКМ CR-349D продуцент эпидермального фактора роста человека. Патент РФ №2150501 от 10.06.2000.

7. Эльдаров М.А., Жгун А.А., Гервазиев Ю.В., Арчаков А.И., Скрябин К.Г., Александрова С.С., Омельянюк Н.М., Арчаков А.И., Скрябин К.Г., Соколов Н.Н. Ген L-аспарагиназы Erwinia carotovora и штамм Escherichia coli ВКПМ №В-8174 - продуцент L-аспарагиназы Erwinia carotovora. Патент РФ № 2221868 от 20.01.2004.

8. Эльдаров М.А., Жгун А.А., Гервазиев Ю.В., Александрова С.С., Богуш В.Г., Сидорук К.В., Свешникова Е.В., Борисова А.А., Омельянюк Н.М., Арчаков А.И., Скрябин К.Г., Соколов Н.Н. Рекомбинантная плазмидная ДНК pACYCLANS для переноса и экспрессии в клетках Escherichia coli L-аспарагиназы Erwinia carotovora (ECAR-LANS) и способ получения рекомбинантной ECAR-LANS из биомассы штамма Escherichia coli- продуцента. Патент РФ № 2224797 от 04.02.2004. 

9. Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Посыпанова Г.А., Шульга А.А., Эльдаров М.А., Кагиянц С.М., Ермолюк Я.С., Северин Е.С., Кирпичников М.П., Скрябин К.Г. Пептидный вектор, способ его получения, нуклеотидная последовательность, рекомбинантная плазмидная ДНК, и штамм Escherichia coli B-8389 ВКПМ для его получения, способ генетической модификации клеток млекопитающих и человека. Патент РФ № 2248983, Приоритет 2005.03.27.

На главную
 
О центре | Администрация | Ученый совет | Структура | Достижения | Аспирантура | Контакты | Карта сайта

Designed by Dioskury